smok SAE ถูกเก็บรวบรวมจากลำดับที่ 10 ถึง 12 หลอดลม

เยื่อบุผิวทางเท้าหายใจขนาด smok เล็กแล้วก็แมวัวรฟาจถุงลมโป่งพองSAE ถูกเก็บรวบรวมจากลำดับที่ 10 ถึง 12 หลอดลมโดยใช้ bronchoscopy แบบยืดหยุ่นดังที่ชี้แจง ไว้ก่อนหน้านี้ที่ผ่านมา 18 เซลล์ SAE ถูกขับออกมาจากแปรง smok เซลล์วิทยาโดยการปัดลงใน Bronchial Epithelium Basal Medium ที่เย็นด้วยน้ำแข็ง 5 มิลลิลิตร (BEBM, Lonza, Basel, Switzerland) รวม ทั้งเก็บไว้ภายในน้ำแข็งจวบจนกระทั่งจะผ่านวิธีการ หนึ่งในห้าของความจุทั้งผองถูกลบออกสำหรับความมีชีวิตของเซลล์และก็การวิเคราะห์เชิงอนุพันธ์ และก็แบบอย่างที่เหลือได้รับการประมวลผลโดยทันทีและก็เก็บไว้ภายในรีเอเจนต์ TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) ที่ − 80 °C จนกว่าวิธีการทำให้ RNA บริสุทธิ์ในเวลาถัดมา AM ถูกกู้คืนโดยการล้างหลอดลม (BAL) 20 จำนวนสูงสุดที่ฉีดต่อไซต์เป็น 150 มิลลิลิตร โดยมีไซต์สูงสุดสองไซต์ต่อบุคคล การฟื้นฟูสภาพของความจุที่ผสมระหว่าง 56.2 ถึง 65.5% (ตารางที่ 1 ) ของเหลวที่กู้คืนทั้งปวงถูกกรองหนแรกผ่านผ้าก๊อซและก็หมุนเหวี่ยงที่ 1250 รอบต่อนาที ตรงเวลา 5 นาที เม็ดเซลล์ถูกแขวนลอ ยใหม่ในบัฟเฟอร์ ACK lysing (5 มิลลิลิตร, 23 °C, 5 นาที; Invitrogen, Carlsbad, CA) หลังจากนั้นล้างสองครั้งใน 10 มิลลิลิตร ของสื่อ RPMI 1640 (Invitrogen) ที่มีซีรั่มโคในท้อง 9% (Sigma Aldric h) , เซนต์หฝ่าส์ มิสซูรี) รวมทั้ง 1% เพนิสิลลินและก็สเตรปโตมัยสิน (Invitrogen) นับเซลล์โดยใช้ฮีโมไซโตมิเตอร์ที่มีการละเว้นทริปแพนบลูเพื่อประเมินความมีชีวิต เม็ดเซลล์ถูกเจือจางให้มีความเข้มข้น 10 6เซลล์/มิลลิลิตร ปริมาณเซลล์ที่ไม่เหมือนกันถูกทำงานบนไซโตเซนตริฟิวจ์ 400 ไมโครลิตร aliquot ที่ย้อมด้วยดิฟฟ์-ควิก เซลล์ที่เหลือถูกชุบลงในจานเพาะเชื้อพลาสติก 6 หลุม ที่ 2 × 10 6เซลล์/2  มิลลิลิตร ต่อหลุม แล้วก็ฟักที่อุณหภูมิ 37 °C ค้างแรมใน 5% CO 2เพื่อ AM บริสุทธิ์โดยการตั้งมั่น 21 หนึ่งในห้าของความจุทั้งผองถูกลบออกสำหรับความมีชีวิตของเซลล์แล้วก็การวิเคราะห์เชิงอนุพันธ์ ร วมทั้งแบบอย่างที่เหลือได้รับการประมวลผลโดยทันทีรวมทั้งเก็บเอาไว้ภายในรีเอเจนต์ TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) ที่ −…

Published by admin inNovember 5, 2022
Tags:
smok

เยื่อบุผิวทางเท้าหายใจขนาด smok เล็กแล้วก็แมวัวรฟาจถุงลมโป่งพอง
SAE ถูกเก็บรวบรวมจากลำดับที่ 10 ถึง 12 หลอดลมโดยใช้ bronchoscopy แบบยืดหยุ่นดังที่ชี้แจง

ไว้ก่อนหน้านี้ที่ผ่านมา 18 เซลล์ SAE ถูกขับออกมาจากแปรง smok เซลล์วิทยาโดยการปัดลงใน Bronchial Epithelium Basal Medium ที่เย็นด้วยน้ำแข็ง 5 มิลลิลิตร (BEBM, Lonza, Basel, Switzerland) รวม

ทั้งเก็บไว้ภายในน้ำแข็งจวบจนกระทั่งจะผ่านวิธีการ หนึ่งในห้าของความจุทั้งผองถูกลบออกสำหรับความมีชีวิตของเซลล์และก็การวิเคราะห์เชิงอนุพันธ์ และก็แบบอย่างที่เหลือได้รับการประมวลผลโดยทันทีและก็เก็บไว้ภายในรีเอเจนต์ TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) ที่ − 80 °C จนกว่าวิธีการทำให้ RNA บริสุทธิ์ในเวลาถัดมา

AM ถูกกู้คืนโดยการล้างหลอดลม (BAL) 20 จำนวนสูงสุดที่ฉีดต่อไซต์เป็น 150 มิลลิลิตร โดยมีไซต์สูงสุดสองไซต์ต่อบุคคล การฟื้นฟูสภาพของความจุที่ผสมระหว่าง 56.2 ถึง 65.5% (ตารางที่ 1 ) ของเหลวที่กู้คืนทั้งปวงถูกกรองหนแรกผ่านผ้าก๊อซและก็หมุนเหวี่ยงที่ 1250 รอบต่อนาที ตรงเวลา 5 นาที เม็ดเซลล์ถูกแขวนลอ

ยใหม่ในบัฟเฟอร์ ACK lysing (5 มิลลิลิตร, 23 °C, 5 นาที; Invitrogen, Carlsbad, CA) หลังจากนั้นล้างสองครั้งใน 10 มิลลิลิตร ของสื่อ RPMI 1640 (Invitrogen) ที่มีซีรั่มโคในท้อง 9% (Sigma Aldric

h) , เซนต์หฝ่าส์ มิสซูรี) รวมทั้ง 1% เพนิสิลลินและก็สเตรปโตมัยสิน (Invitrogen) นับเซลล์โดยใช้ฮีโมไซโตมิเตอร์ที่มีการละเว้นทริปแพนบลูเพื่อประเมินความมีชีวิต เม็ดเซลล์ถูกเจือจางให้มีความเข้มข้น 10

6เซลล์/มิลลิลิตร ปริมาณเซลล์ที่ไม่เหมือนกันถูกทำงานบนไซโตเซนตริฟิวจ์ 400 ไมโครลิตร aliquot ที่ย้อมด้วยดิฟฟ์-ควิก เซลล์ที่เหลือถูกชุบลงในจานเพาะเชื้อพลาสติก 6 หลุม ที่ 2 × 10 6เซลล์/2

 มิลลิลิตร ต่อหลุม แล้วก็ฟักที่อุณหภูมิ 37 °C ค้างแรมใน 5% CO 2เพื่อ AM บริสุทธิ์โดยการตั้งมั่น 21 หนึ่งในห้าของความจุทั้งผองถูกลบออกสำหรับความมีชีวิตของเซลล์แล้วก็การวิเคราะห์เชิงอนุพันธ์ ร

วมทั้งแบบอย่างที่เหลือได้รับการประมวลผลโดยทันทีรวมทั้งเก็บเอาไว้ภายในรีเอเจนต์ TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) ที่ − 80 °C จวบจนกระทั่งวิธีการทำให้ RNA บริสุทธิ์ในเวลาถัดมา

ตารางที่ 1 ข้อมูลมวลชนของมวลชนที่เล่าเรียนแล้วก็แบบอย่างด้านชีววิทยาa
ตารางขนาดเต็ม
สำหรับทั้งยัง SAE และก็ AM แยก RNA ทั้งปวงโดยใช้แนวทาง TRIzol ด้วยการล้างตัวอย่างขั้นตอนสุดท้ายโดยใช้คอลัมน์ RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) จำนวนรวมทั้งประสิทธิภาพของ RNA ได้รับการคาดการณ์โดย Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE) แล้วก็ Bioanalyzer (Agilent Technolo

gies, Santa Clara, CA) เป็นลำดับ RNA ทั้งปวง (0.5 ไมโครกรัม) ถูกส่งไปยัง New York Genome Center ในการจัดอันดับ RNA (2 × 125 bp) บน Illumina HiSeq2500 ตามการเตรียมไลบรารี TruSeq v2

mRNA ข้อมูลนี้เผยต่อสาธารณะใน NCBI Gene Expression Omnibus (เลขลำดับภาคยานุวัติ GEO: GSE85121) Illumina HiSeq การอ่านแบบคู่ขนานจากข้อมูล NYGC RNA-Seq ถูกประเมินผลด้วย STAR (2.3.1z13_r470

) เพื่อจัดตำแหน่งการอ่านให้สอดคล้องกับจีโนมอ้างอิงของผู้คน GRCh37/hg19 และก็คำนิยามของยีน RefSeq (2014–06-02) การหาจำนวนการแสดงออกของยีนจัดการโดยใช้กระดุมข้อมือ (2. 2) ตรงข้ามความหมายของยีน RefSeq สำ

หรับเพื่อการปรับแต่งความยาวการถอดเสียงรวมทั้งความลึกของการปกคลุมปกคลุม Cufflinks จะแปลงการอ่านที่จัดแนวเป็นส่วนย่อยต่อกิโลเบสของ exon ต่อล้านส่วนย่อยที่เรียงลำดับ (FPKM) สำหรับในการแสดงออกโดยใช้คำอธิบายศัพท์ของยีน RefSeq เดียวกัน สำหรับนิพจน์ SAE จะรวมค่าของ FPKM > 0.125 24 สำหรับในการแสดงออก AM จะรวมค่าของ FPKM > 0.08